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xi胞培养基

一、 xi胞培养基的gai念和原理
xi胞培养基是rengong模拟xi胞在体内生长的ying养环綾hang翘峁﹛i胞ying养和促jinxi胞生长增殖的wu质基chu。培养ye或培养基的含义几乎相同,ying文都是medium。当它是粉jishi,倾向xing地称为培养基,而将粉ji配成ye体hou,多称为培养ye。培养ye中changchang补加血qing、***deng成fen。培养基主yao包括tianranxi胞培养基、合成xi胞培养基和wu血qingxi胞培养基deng。

tianranxi胞培养基是renmenzao期采用的xi胞培养基,直統ou∽杂诙痺u组织提取ye或体ye,ru血浆凝块、血qing、**ye、pei胎浸出yedeng。ying养价值高,但成fen复杂,差异大、不稳ding,来yuan也shoudao限制。水解rudan白和胶原是两种较好的tianran培养基,富含氨基suan。血qing是tianran培养基中*有效和*chang用的培养基,但其组成成fen复杂,其中一些成fen与功能不明que。血qing的来yuan有胎牛血qing、xiao牛或成牛血qing、ma血qing、鸡血qing、羊血qing及ren血qing,*广泛应用的为胎牛血qing和xiao牛血qing。

合成xi胞培养基是用化学成fen明que的试ji配制的培养基,组fen稳ding,主yao包括tanglei、必需氨基suan、维生素、wu机盐leideng。自1950 年199 xi胞培养基问世以来,合成xi胞培养基发展至jin已有几shi种,除了yan用半个世ji的基chu合成xi胞培养基之外,jin年来还出xian了ying养成fen更加丰富的低血qingxi胞培养基。由于xi胞种lei和培养条jian不同,适宜的合成xi胞培养基也不同,在动wuxi胞培养中*chang用基chuxi胞培养基有6~7 种,ruBME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 deng。由于tianran培养基的一些ying养成fen不能被合成xi胞培养基完全代替,因此一般需在合成xi胞培养基中添加5%~10%的xiao牛血qing。xiao牛血qing的紋ou攵詘i胞培养非chang有效,但xiao牛血qing的成fen复杂,这对培养chanwu的fen离纯化和检ce会带来一ding的不便,为减少xiao牛血qing的ying响,开发了ying养成fen更加丰富的低血qingxi胞培养基,ke以将xiao牛血qing的shi用量降低dao1~3%。

wu血qingxi胞培养基(serum free medium, SFM)是指在shi用中wu需添加血qing的xi胞培养基,且其组成成fen不含有任何动wu组fen。an照其组fenfenlei,还ke以fen为wu动wu组fenwu血qingxi胞培养基和化学限dingwu血qingxi胞培养基,前者组fen中ke能含有某些謈an锢磞uan成fen,而hou者完全由化学成fen明que的组fen组成。其中,wu动wu组fenwu血qingxi胞培养基是mu前在生wu制药行业中应用*广泛的,它提高了xi胞培养的质量,避mian了shi用血qing带来的麻烦。mu前,已有多种wu血qing培养基上市,ru杂交瘤xi胞wu血qing培养基、CHOxi胞wu血qing培养基、Veroxi胞wu血qing培养基和NS0 xi胞wu血qing培养基deng。wu血qing培养基通chang添加生长fu加成fen,ru**与生长因子、低fen子ying养成fen和转铁dan白deng促xi胞生长的fu加成fen,一般包括胰岛素、孕酮、硒suan钠、腐an、转铁dan白deng。

xi胞培养基是xi胞培养的基chu,它为动wuxi胞的健康快速成长提供ying养wu质。所以只yao用daoxi胞来制造生wu技shujin世hao娱乐下载,xi胞培养基的重yao作用jiuwuke替代。

er、xi胞培养基的种lei与基本成fen

2.1 tianran培养基
tianran培养基是指来自动wu体ye或利用组织fen离提取的一lei培养基,ru血浆、血qing、**ye、鸡pei浸出yedeng。组织培养技shu建lizao期,体外培养xi胞都是利用tianran培养基。但是由于tianran培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐jian被合成培养基所替代。

2.1.1 xiao牛血qing

用于xi胞培养的血qing主yao是牛血qing,培养某些特殊xi胞也用ren血qing、ma血qingdeng。选ze用牛血qing培养xi胞的原因主yao是来yuan充足、制备技shu成熟、经过长shi间的应用考验renmen对其有比较深入的理解。牛血qingfen为xiao牛血qing、新牛血qing、胎牛血qing。xiao牛血qing取自出生10~30 tian的xiao牛;新牛血qing取自出生24xiaoshi之内的新生牛;胎牛血qing应取自剖腹chan的胎牛。显ran,胎牛血qing是苀en?高的,因为胎牛还未接触外界,血qing中所含祄u固濉⒉固錮eng对xi胞有害的成fen*少。牛血qing对绝大多shu哺ru动wuxi胞都是适簒i模⒉慌懦谂嘌持謝i胞shishi用其他动wu血qing更合适。牛血qing中含有丰富的xi胞生长必须的ying养成份,具有极为重yao的功能。

1) 血qing主yao作用

(1) 提供基本ying养wu质:氨基suan、维生素、wu机wu、脂leiwu质、核suan衍生wudeng,是xi胞生长必须的wu质。

(2) 提供**和各种生长因子:胰岛素、肾上xian皮质**(氢化ke的松、地sai米松)、lei固醇**(雌er醇、睾酮、孕酮)deng。生长因讁ou绯上宋瑇i胞生长因子、表皮生长因子、血xiao板生长因子deng。

(3) 提供结合dan白:结合dan白作用是携带重yao的低fen子量wu质,ru白dan白携带维生素、脂肪、以及**deng,转铁dan白携带铁。结合dan白在xi胞代谢过程中起重yao作用。

(4) 提供促接触和shen展因子shixi胞贴壁mianshou机xie损伤,对培养謝ie膞i胞起dao某些保护作用。

2) 优dian和缺dian

血qing是非chang复杂的混合wu,成fen多样,含有各种生理平衡的fen子量差别很大的生wufen子,觴ie亩詘i胞生长有促jin作用,ru含有携带**、矿wu质、微量元素和脂leiwu质的转运dan白deng。血qing能够提供xi胞贴壁因子和扩散因子。血qing中含有起稳ding作用和**的因子,能够维持培养基的pH 值并抑制dan白mei直接或间接的胒u狻5茄猶ing的紋ou胍泊戳撕芏辔侍猓裹br /> (1) 血qing的成份ke能有几百种之多,mu前对其准que的成份、含量及其作用机制reng不qing楚,you其是对其中一些多肽lei生长因子、**和脂leidengshang未充fen认识,这给研jiugong作带来xu多困难;

(2) 血qing都是批羕e鷆han,各批量之间差异很大,而且血qing保cun期至多一年,因此,yao保证每批血qing的相似xing极为困难,从而shi实验的标准化和连续xingshoudao限制;

(3) 不能排除血qing中含有yi变wu质,这被认为是“ping中e化”的原因之一。

(4) 秠uan蠖鄐huxi胞,在体内状态,血qing不是它men接触的生理学ye体,只是在损伤**以及血ye凝固过程中才接触血qing,因此shi用血qing有ke能改变某种xi胞在体内的正chang状态,血qingke能促jin某些xi胞的生长(成纤维xi胞)同shi抑制ling一leixi胞生长(表皮xi胞)。

(5) 血qing含一些对xi胞chan生毒xing的wu质,ru多an氧化mei,能与来自高秖ue敝硏i胞的多an反应(ru精an、亚精an)形成有xi胞毒xing作用的聚精an。补体、抗体、****deng都会ying响xi胞生长,甚至造成xi胞死亡。

(6) 取材中ke能带入支原体、病毒,对xi胞chan生qian在ying响。

(7) 血qing的shi用shi得实验和生chan的标准化困难,其謝ie膁an白质shi得某些转基因dan白生wu药品生chan中fen离纯化gong作很难完成。

(8) 大规模生chan中,血qing来yuan越来越困难,价格ang贵,是构成生chan成本的主yao部fen之一。

(9) 为了shi与传染yuan相guan的风险减少dao*低,cun在多个guo家间限制jin出口生wu材liao的guo际法规。
2.1.2 水解rudan白

水解rudan白(Lactalbumin Hydrolysate )为ru白dan白经dan白mei和肽mei水解的chanwu,含有丰富的氨基suan。既ke用于**微生wu培养,又ke用于动wuxi胞培养。xi胞培养中一般为0.5%水解rudan白(经平衡盐溶解)与合成培养基(ruMEM)an1:1混合shi用。mu前在生chan中主yao用于低鼠肾xi胞dengxi胞的培养和维持。但是水解rudan白的shi用也给生wu制品的生chan带来一ding的风险。首先由于水解rudan白xi或者制品带来风险。其次水解rudan白糰ng卸痺u组fen培养基的shi用,shi生wu制品下游chu理变祄ei丛樱舛杂赿an白质**显祄ei又貀ao。因为从动wuxi胞中生chan生wu药品,其mian临的*大困难jiu是ru何去除内yuan或同yuandan白。不queding的成fen,像动wu肽leiwu质的引入,势必会增加提取、fen离、纯化的步骤,一方mianshi成本提高,ling一方mian也会ying响生wu制品的chan量和质量。

2.2平衡盐溶ye

平衡盐溶ye(balanced salt solution,BSS )简称盐溶ye,集缓冲ye的缓冲能li、生理盐水的deng渗xing以及培养ye的ying养供应特dian于一体,jian具维持渗透压、缓冲和调节溶ye的suan碱度、同shi供给xi胞生cun所必需的能量和wu机纆uang映蒮en的作用。各种BSS的缓冲xi统有所不同,其中以Hank’sye和Earle’sye为例,它men主yao差别在于碳suan氢钠的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中眗eng贖ank’s (0.35 g/L) 中高。碳suan氢钠需觤ei咚降腃O2平衡,以维持溶ye的pH值。Eaglesye在空qi水平的CO2 中,溶ye会变碱,Hank’sye在CO2培养xiang中会变suan。ru果希望在CO2培养xiang中保cun组织,需yao用Earle’sye,。ru果jinjin是qing洗将yao在xi胞培养基中储cun的组织,用Hank’syejiuke以了。

一些BSS含觴ie腃a2+、Mg2+是xi胞膜的重yao组成成fen,同shican与xu多重yao的xi胞功能活动。但它men有shixi胞凝集的作用,在配制fen散xi胞的消化ye和特殊用途的xi胞洗涤shi,宜采用Ca2+、Mg2+含量絰i偷腄ulbeccoye或wuCa2+、Mg2+的D-Hanksye,或者PBSye。

2.3基chu培养基

2.3.1 gaishu

基chuxi胞培养基主yao包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12deng。主yao成fen是氨基suan、维生素、碳水化合wu、wu机盐和其它一些辅助wu质。rengong合成培养基shi用shi还需添加一ding量的血qingshixi胞生长和繁殖。

2.3.2 组成及作用

氨基suan:组成dan白质的基本dan位。不同的xi胞对氨基suan的需求各异,但几种必需氨基suanxi胞自身不能合成,必须依kao培养ye提供,ru组氨suan、异亮氨suan、亮氨suan、纃an眘uan、dan氨suan、苯丙氨suan、苏氨suan、se氨suan、鐈ing眘uan、半guang氨suan、酪氨suandeng。其yu穛ian匦璋被鵶uan,xi胞ke以自己合成,或通过转氨作用由其他wu质转化而纁hu>蟛縡enxi胞对谷氨酰an有絰i叩膟ao求,因为谷氨酰an是作为能yuan

及碳yuanwu质同shi被xi胞利用,是是xi胞合成核suan和dan白謘hi匦璧陌被鵶uan,在缺少谷氨酰anshi,xi胞生长不佳而死亡,所以各种培养ye中都含有较多的谷氨酰an。xi胞所能利用的氨基suan是L型同fen异构体,D型氨基suan不能被利用。
维生素:维持xi胞生长的一种生wu活xingwu质,对xi胞代谢有重大作用。它men在xi胞中大多形成mei的辅基或辅mei,没有它men,mei便没有活xing,代谢活动将wu法jin衳iaoN豧en为水溶和脂溶两大lei,的培养ye中直接采用ATP和辅meiA。

葡萄tang:大部fen培养基都以葡萄tang作为能量来yuan之一。

wu机盐:维持培养基渗透压平衡,can与xi胞的代谢活动。主yao有Na+、K+、Ca2+、Mg2+deng。Na+是xi胞外ye中*主yao的阳纆uang樱晕稚秆沟暮鉪ing有决dingxing的作用。K+主yaofen布在xi胞内ye,xi胞内K+对于ji活某些mei蕅ian匦璧模⒃诘鹘趚i胞内环境的suan碱平衡上也有极重yao意义。Ca2+在xi胞外ye謝ie淖饔檬墙橹诓縳i胞之间相互zhan着,在xi胞内can与xu多重yao的xi胞生理活动,ru传导、can与肌肉xi胞shou缩deng。在悬fu培养shi,为了减少xi胞的聚集和fu着,yao减少Ca2+的nong度。Mg2+是构成xi胞间质的重yao成fen,对于xi胞间相互稳ding结合有很重yao的意义。磷的化合wu对xi胞wu质代谢和生理功能调控有重yao作用。

其他成fen:肽、核苷、嘌呤deng。ke帮助xi胞祄u寺』嘌拔帜承┨厥鈞i胞xi的生长。