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chao滤离心管使用方法和zhu意事项  

蛋白nong缩和换Buffertong常使用dechao滤管,常用MilliporedeAmicon-Ultra-15chao滤管(MWCO10kD)。也有其它型号de、不tong体积大小和MWCOchao滤管可选,视目de蛋白defen子量与nong缩前体积、nong缩目标体积而定。可zhongfu使用。  

1、选择合shidechao滤管,主yao考虑MWCO和nong缩体积,tong常应jie留fen子量不应大于目de蛋白fen子量de1/3,眗e缒縟e蛋白fen子量为35kDa,就可以选择10kDajie留fen子量dechao滤管。若目de蛋白fen子量为10kD左you,ze可以用jie留fen子量3kDdechao滤管。  

2、新买来dechao滤是干燥de,使用前加ruMilliQ水,水量完全guo膜,冰浴huo冰箱li预冷几fen钟。然后jiang水dao出,ji可加ru蛋白ye,加rude多少,以不chaoguo管顶de白线为准。操zuoyaoqing,加ru蛋白ye前,chao滤管需yaocha在冰上预冷。  

3、平衡。质量和zhong心二者都yao达dao平衡。zhu意转速和加速度不可太快,fuzezhi接损坏chao滤膜。kai始离心chao滤(离心机预冷zhi4度)。膜与转轴de方向根据说ming书调整(jiao转离心机de情kuang是膜与轴chuizhi)。在蔰aoshi褂弥校话阕賙aide比说ming书lideyao低,这样可以yan长离心管de使用寿ming。

  4、当nong缩dao剩下1ml时,【取50ul国产Bradford溶ye,加ru10ulliu穿,看有没变lan色,以ci判断chao滤管是fu漏掉蛋白。如果管漏了,jiang上层和liu穿zhong新daoru新管中kai始chao滤。yao**判断是fu漏管,用5mg/mldeBSA离心10min,再取liu穿,跑蛋白胶huoBradfordcuce】,jixu加ru剩下de蛋白yenong缩(在冰上操zuo,防止蛋白受re),zhidao所有nong缩ye都加完为止。离心guo程中zhu意是fufasheng蛋白沉淀,dao致堵管。若fasheng沉淀,yao确定沉淀de具体原因,是蛋白nong度guo高还是Buffer不合shi;前者可用多根chao滤管tong时chao滤,降低nong度de办法解决,后者de方法是换不tongdeBuffer,zhidao蛋白不fasheng沉淀为止。  

5、前面几步用以nong缩蛋白,如果yao换Buffer,在zong蛋白yenong缩zhi1ml左youde时候,qingqing加ru新deBuffer(经0.22umchao滤膜chao滤),再nong缩zhi1ml左you,连xu三次,*后一次denong缩终体积根据需yaode蛋白nong度而定,一般不多于500ul,也有nong缩zhi200ul以内de情kuang。an照每次zhi少10倍左youde体积nong缩算,三次达dao1000倍以上,基本上可以达dao换bufferde目de。 

 6、取出*终蛋白nong缩yede操zuo在冰上操zuo,用黄枪头(200ul)取,qingqing顺着bian缘charu枪头,qingqing吹打、混匀蛋白ye,zhu意不yaopengdaochao滤膜,然后吸取nong缩ye,每次吸接近200ul,zhidao吸完。管底剩下de*后一点nong缩ye不必吸取,fuze难度太大,有可能损坏chao滤膜。*后加ruMilliQ水daochao滤管中,没guochao滤膜,防止膜失水变干。